Live cell imaging reveals focal adhesions mechanoresponses in mammary epithelial cells under sustained equibiaxial stress

Mechanical stimuli play a key role in many cell functions such as proliferation, differentiation and migration. In the mammary gland, mechanical signals such as the distension of mammary epithelial cells due to udder filling are proposed to be directly involved during lactation and involution. However, the evolution of focal adhesions -specialized multiprotein complexes that mechanically connect cells with the extracellular matrix- during the mammary gland development, as well as the influence of the mechanical stimuli involved, remains unclear. Here we present the use of an equibiaxial stretching device for exerting a sustained normal strain to mammary epithelial cells while quantitatively assessing cell responses by fluorescence imaging techniques. Using this approach, we explored changes in focal adhesion dynamics in HC11 mammary cells in response to a mechanical sustained stress, which resembles the physiological stimuli. We studied the relationship between a global stress and focal adhesion assembly/disassembly, observing an enhanced persistency of focal adhesions under strain as well as an increase in their size. At a molecular level, we evaluated the mechanoresponses of vinculin and zyxin, two focal adhesion proteins postulated as mechanosensors, observing an increment in vinculin molecular tension and a slower zyxin dynamics while increasing the applied normal strain.Fil: Sigaut, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Von Bilderling, Catalina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Bianchi, Micaela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Burdisso, Juan Eduardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; ArgentinaFil: Gastaldi, Laura Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; ArgentinaFil: Pietrasanta, Lia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentin

Correlation of cellular traction forces and dissociation kinetics of adhesive protein zyxin revealed by multi-parametric live cell microscopy

Cells exert traction forces on the extracellular matrix to which they are adhered through the formation of focal adhesions. Spatial-temporal regulation of traction forces is crucial in cell adhesion, migration, cellular division, and remodeling of the extracellular matrix. By cultivating cells on polyacrylamide hydrogels of different stiffness we were able to investigate the effects of substrate stiffness on the generation of cellular traction forces by Traction Force Microscopy (TFM), and characterize the molecular dynamics of the focal adhesion protein zyxin by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) and Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). As the rigidity of the substrate increases, we observed an increment of both, cellular traction generation and zyxin residence time at the focal adhesions, while its diffusion would not be altered. Moreover, we found a positive correlation between the traction forces exerted by cells and the residence time of zyxin at the substrate elasticities studied. We found that this correlation persists at the subcellular level, even if there is no variation in substrate stiffness, revealing that focal adhesions that exert greater traction present longer residence time for zyxin, i.e., zyxin protein has less probability to dissociate from the focal adhesion.Fil: Sigaut, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Bianchi, Micaela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Von Bilderling, Catalina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Pietrasanta, Lia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin

Messages Do Diffuse Faster Than Messengers: Reconciling disparate estimates of the morphogen Bicoid diffusion coefficient

The gradient of Bicoid (Bcd) is key for the establishment of the anterior-posterior axis in Drosophila embryos. The gradient properties are compatible with the SDD model in which Bcd is synthesized at the anterior pole and then diffuses into the embryo and is degraded with a characteristic time. Within this model, the Bcd diffusion coefficient is critical to set the timescale of gradient formation. This coefficient has been measured using two optical techniques, Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), obtaining estimates in which the FCS value is an order of magnitude larger than the FRAP one. This discrepancy raises the following questions: which estimate is ?correct?; what is the reason for the disparity; and can the SDD model explain Bcd gradient formation within the experimentally observed times. In this paper, we use a simple biophysical model in which Bcd diffuses and interacts with binding sites to show that both the FRAP and the FCS estimates may be correct and compatible with the observed timescale of gradient formation. The discrepancy arises from the fact that FCS and FRAP report on different effective (concentration dependent) diffusion coefficients, one of which describes the spreading rate of the individual Bcd molecules (the messengers) and the other one that of their concentration (the message). The latter is the one that is more relevant for the gradient establishment and is compatible with its formation within the experimentally observed times.Fil: Sigaut, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Pearson, John E.. Los Alamos National Laboratory;Fil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin

Loop A Is Critical for the Functional Interaction of Two Beta vulgaris PIP Aquaporins

Research done in the last years strongly support the hypothesis that PIP aquaporin can form heterooligomeric assemblies, specially combining PIP2 monomers with PIP1 monomers. Nevertheless, the structural elements involved in the ruling of homo versus heterooligomeric organization are not completely elucidated. In this work we unveil some features of monomer-monomer interaction in Beta vulgaris PIP aquaporins. Our results show that while BvPIP2;2 is able to interact with BvPIP1;1, BvPIP2;1 shows no functional interaction. The lack of functional interaction between BvPIP2;1 and BvPIP1;1 was further corroborated by dose-response curves of water permeability due to aquaporin activity exposed to different acidic conditions. We also found that BvPIP2;1 is unable to translocate BvPIP1;1-ECFP from an intracellular position to the plasma membrane when co-expressed, as BvPIP2;2 does. Moreover we postulate that the first extracellular loop (loop A) of BvPIP2;1, could be relevant for the functional interaction with BvPIP1;1. Thus, we investigate BvPIP2;1 loop A at an atomic level by Molecular Dynamics Simulation (MDS) and by direct mutagenesis. We found that, within the tetramer, each loop A presents a dissimilar behavior. Besides, BvPIP2;1 loop A mutants restore functional interaction with BvPIP1;1. This work is a contribution to unravel how PIP2 and PIP1 interact to form functional heterooligomeric assemblies. We postulate that BvPIP2;1 loop A is relevant for the lack of functional interaction with BvPIP1;1 and that the monomer composition of PIP assemblies determines their functional properties.Fil: Jozefkowicz, Cintia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Rosi, Pablo Eduardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; Argentina;Fil: Sigaut, Lorena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Soto, Gabriela Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias. Centro de Investigación de Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Genética; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Pietrasanta, Lia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Amodeo, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Alleva, Karina Edith. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Rab27a controls HIV-1 assembly by regulating plasma membrane levels of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

During the late stages of the HIV-1 replication cycle, the viral polyprotein Pr55Gag is recruited to the plasma membrane (PM), where it binds phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) and directs HIV-1 assembly. We show that Rab27a controls the trafficking of late endosomes carrying phosphatidylinositol 4-kinase type 2 α (PI4KIIα) toward the PM of CD4+ T cells. Hence, Rab27a promotes high levels of PM phosphatidylinositol 4-phosphate and the localized production of PI(4,5)P2, therefore controlling Pr55Gag membrane association. Rab27a also controls PI(4,5)P2 levels at the virus-containing compartments of macrophages. By screening Rab27a effectors, we identified that Slp2a, Slp3, and Slac2b are required for the association of Pr55Gag with the PM and that Slp2a cooperates with Rab27a in the recruitment of PI4KIIα to the PM. We conclude that by directing the trafficking of PI4KIIα-positive endosomes toward the PM, Rab27a controls PI(4,5)P2 production and, consequently, HIV-1 replication.Fil: Pereyra Gerber, Federico Pehuén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida; ArgentinaFil: Cabrini, Mercedes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida; ArgentinaFil: Jancic, Carolina Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; ArgentinaFil: Paoletti, Luciana Elisa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Banchio, Claudia Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Von Bilderling, Catalina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Sigaut, Lorena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Pietrasanta, Lia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Duette, Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida; ArgentinaFil: Freed, Eric O.. National Cancer Institute at Frederick; Estados UnidosFil: Basile, Genevieve de Saint. Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale; FranciaFil: Moita, Catarina Ferreira. Instituto Gulbenkian de Ciencia; PortugalFil: Moita, Luis Ferreira. Instituto Gulbenkian de Ciencia; PortugalFil: Amigorena, Sebastian. Institute Curie; FranciaFil: Benaroch, Philippe. Institute Curie; FranciaFil: Geffner, Jorge Raúl. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida; ArgentinaFil: Ostrowski, Matias. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida; Argentin

Quantitative characterization of intracellular calcium signaling

Las señales de calcio son utilizadas por una enorme variedad de células para regular procesos tan distintos como la fertilización o la muerte celular, entre muchos otros. La versatilidad del ión calcio como agente señalizador se basa en la gran diversidad de comportamientos que su concentración puede desplegar dentro de las células. Desentrañar la compleja trama de mecanismos que determinan dichos comportamientos es un enorme desafío que requiere la combinación de estrategias múltiples tanto experimentales como de modelado. En particular, el amplio rango de escalas espaciales y temporales involucradas no puede ser abarcado con un unico tipo de experimentos y es entonces que la elaboración de modelos que permitan conectar observaciones dispares se vuelve indispensable. Por otro lado, para que los modelos puedan cumplir este rol es necesario contar con estimaciones confiables, idealmente obtenidas in situ, de algunas de las cantidades que caracterizan a los fenómenos físicos y químicos involucrados en las señales. El objetivo de esta Tesis ha sido avanzar en la obtención de estas estimaciones realistas realizando experimentos opticos y desarrollando el marco teórico necesario para extraer información cuantitativa de los mismos. Una de las propiedades pobremente caracterizadas es la tasa a la que el calcio se transporta dentro de las células. Existen distintas técnicas opticas para estimar coeficientes de difusión, entre las que se encuentran la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) o la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP). La aplicación de las mismas al caso del calcio no es totalmente directa, ya que este ión no sólo difunde al entrar al citosol a través de canales específicos, sino que también reacciona con distintas sustancias (“buffers”) que poseen las células. Para describir este tipo de transporte es posible definir coeficientes efectivos, que contienen información sobre la difusión y las reacciones. Estudios preliminares habrán mostrado la existencia de más de un coeficiente de este tipo. Una de las contribuciones de esta Tesis ha sido estudiar de forma detallada la información que es posible extraer a partir de experimentos de FCS en donde la sustancia observada difunde y reacciona. En particular, se demostró que las técnicas de FCS y FRAP brindan información sobre coeficientes distintos, que puede ser combinada para inferir tasas de reacción yo de difusión libre. Se realizó este estudio teórico para el caso en que la sustancia de interés está marcada fluorescentemente y cuando existen moléculas marcadas y no marcadas en el mismo sistema. Parte de los resultados fueron aplicados para explicar las diferencias observadas en experimentos de FCS y FRAP, realizados para deter minar el coeficiente de difusión del producto del gen bicoid en embriones de moscas Drosophila melanogaster, una sustancia fundamental para el establecimiento del eje dorsoventral en este organismo. La aplicación de técnicas opticas para estudiar el transporte de calcio en células presenta dificultades adicionales. En primer lugar, la observación de la distribución del calcio se hace de modo indirecto, mediante fluoróforos que reaccionan con este ión y cambian sus propiedades espectrales como por ejemplo, aumentar notablemen te la fluorescencia al ligar calcio. Es decir, la sustancia observable (indicador ligado a calcio) está permanentemente transformándose en otra. Por otro lado, para poder inferir a partir de ella la distribución de calcio libre es necesario conocer propiedades del indicador que típicamente no son provistas por quienes lo comercializan, como por ejemplo, los coeficientes de difusión. Otra de las contribuciones de esta Tesis ha sido establecer las bases para la determinación de los coeficientes de difusión y tasas de reacción del calcio y sus fluoróforos, en células. Para tal fin se hicieron, en primer lugar, experimentos de FCS en distintos tipos de soluciones conteniendo calcio e indicador. Se trabajó simultáneamente en los desarrollos teóricos necesarios para el análisis de los mismos. De su aplicación se pudieron determinar coeficientes de difusión y parámetros de reacción en solución. Entre los experimentos se realizó un subconjunto conteniendo calcio, indicador y un “buffer” adicional. A partir del estudio detallado de estos ultimos se elaboró una propuesta de cómo obtener estos coeficientes en células intactas donde las propiedades de los “buffers” presentes son desconocidas. La versatilidad de las señales intracelulares de calcio depende, entre otras cosas, de la distribución espacial y de la cinética de los canales a través de los cuales los iones ingresan al citosol. Entre estos, los receptores de inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3 R) constituyen una de las vías más importantes para este ingreso. Estos canales se encuentran en la membrana del retículo endoplasmático organizados en cúmulos que se supone son de unos 100 nm de lado y que están, a su vez, separados por algunos milímetros entre sí. Los canales se abren cuando ligan calcio e IP3 R el que, en condiciones fisiológicas, es sintetizado a partir de elementos presentes en la membrana plasmática cuando la célula recibe una señal. La distribución inhomogénea de los canales junto con el efecto del calcio liberado sobre la probabilidad de aper- tura se combinan para dar lugar a una jerarquía de señales que van desde las muy localizadas hasta las ondas que viajan por toda la célula. Contar con información cuantitativa sobre la geometría de los cúmulos y sobre la cinética de los canales in situ es fundamental para entender la variedad de señales que pueden evocarse. Experimentalmente es posible observar las señales usando los fluoróforos antes mencionados e induciendo la apertura de los canales con IP3 , que es introducido en la célula en forma enjaulada y posteriormente fotoliberado con luz ultravioleta. Otra de las contribuciones del presente trabajo de Tesis ha sido el diseño e implementación de una adaptación relativamente barata de un microscopio confocal Olympus FV1000 para realizar este tipo de experimentos. La habilidad del sistema para fotolizar compuestos enjaulados fue comprobada en distintas situaciones experimentales. Por otro lado, la potencia que llega a la muestra y el tamaño de la zona iluminada fueron cuantificados. Finalmente, en el trabajo se ha mostrado también que con esta adaptación es posible generar un est ́mulo preciso y controlado de IP3 simultáneamente a la obtención de imágenes confocales de señales de calcio, registrando y caracterizando a las mismas en ovocitos de Xenopus Laevis.Calcium signals are used by an enormous variety of cells to regulate processes as diverse as fertilization or cell death, among others. The versatility of calcium as a signaling agent is based on the great diversity of behaviors that its concentration can display inside cells. Unveiling the complex network of mechanisms that determine these behaviors is an enormous challenge that requires the combination of multiple strategies which include experiments and modeling. In particular, the wide range of spatial and temporal scales involved can not be covered with a single type of expe- riment, so that the development of models that can connect different observations becomes unavoidable. On the other hand, for models to fulfill this role is necessary to have reliable estimates, ideally obtained in situ, of some of the quantities that cha- racterize the physical and chemical phenomena involved in the signals. The aim of this Thesis has been to advance in obtaining these realistic estimates by performing optical experiments and developing the theoretical framework necessary to extract quantitative information from them. One poorly characterized property is the rate of calcium transport inside cells. There are several optical techniques to estimate diffusion coefficients, among them, Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) and Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Applying these techniques to the case of calcium is not entirely straightforward, since this ion not only diffuses, when it enters the cytosol through specific channels, but also reacts with various substances (“buffers”) inside cells. Effective coefficients can be defined to describe this type of transport, which contain information on the diffusion and reaction parameters. Preliminary studies had shown the existence of more than one of these coefficients. One contribution of this Thesis has been a detailed study of the information that can be obtained from FCS experiments in which the particles observed diffuse and react. In particular, it was proved that FCS and FRAP provide information about different coefficients which can be combined to infer reaction and free diffusion rates. A theoretical study was done for the case in which the molecule of interest is fluorescently labeled and when there are fluorescently labeled and unlabeled molecules in the same system. Part of the results were applied to explain the differences observed in FCS and FRAP experiments, performed to determine the diffusion coefficient of bicoid in Drosophila melanogaster embryos, an essential substance for the formation of the dorsoventral axis in this organism. The application of optical techniques to study calcium transport in cells offers additional difficulties. First of all, the observation of the calcium distribution is indirect, by means of fluorophores that react with this ion and change their spectral properties upon binding (e.g. increasing their fluorescence when they are bound to calcium). Thus, the observable particle (indicator bound to calcium) is permanently transforming into another. On the other hand, to infer the distribution of free cal- cium it is necessary to know indicator properties that are not usually provided by the vendor, for example, diffusion coefficients. Another contribution of this Thesis has been to establish the basis for the determination of diffusion coefficients and reaction rates of calcium and fluorophores in cells. To this aim, firstly, FCS experiments in different types of solutions containing calcium and indicator were performed. At the same time, the theoretical framework for the analysis of the results was developed. Applying this theory, diffusion coefficients and reaction parameters could be deter- mined for the experiments in solution. Among the experiments, a subset containing calcium indicator and an additional buffer was performed. From a detailed study of the latter, a proposal was made on how to obtain these coefficients and parameters in intact cells where the properties of the endogenous buffers are unknown. The versatility of intracellular calcium signals depends, among other things, on the spatial distribution and kinetics of the channels through which the ions enter the cytosol. Among them, the inositol (1,4,5)-triphosphate receptors (IP3 R) are one of the most important ways for this entry. These channels are located on the mem- brane of the endoplasmic reticulum, organized in clusters of about 100 nm in side which are separated by a few millimeters. These channels become open when they bind calcium and IP3 which, under physiological conditions, is synthesized from elements present in the plasma membrane upon the arrival of a signal. The inhomogeneous distribution of the channels together with the effect of the free calcium on the open probability are combined to give rise to a hierarchy of signals, ranging from very localized ones to waves that travel throughout the cell. Having quantitative information on the clusters geometry and channels kinetics it in situ is essential for understanding the variety of signals that can be evoked. Experimentally, it is possible to observe these signals using the fluorophores mentioned before and indu- cing the opening of IP3 receptor/channels by introducing a caged form of IP3 into the cell and then fotoreleasing it with ultraviolet light. Another contribution of this Thesis has been the design and implementation of a relatively inexpensive adapta- tion of an Olympus FV1000 confocal microscope to perform such experiments. The system’s ability to photolyze caged compounds was tested in different experimental situations. The power that reaches the sample and the size of the illuminated area were also quantified. Finally, in this work it has also been demostrated that with the modified microscope it is possible to generate a precise and controlled IP3 stimulus, simultaneously with the confocal imaging of the evoked calcium signals. This has been proved by recording and characterizing such images in Xenopus laevis oocytes.Fil:Sigaut, Lorena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Ca2+ images obtained in different experimental conditions shed light on the spatial distribution of IP3 receptors that underlie Ca2+ puffs

Many intracellular Ca2+ signals involve Ca2+ release from the endoplasmic reticulum through inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3Rs). The open probability of IP3Rs depends on cytosolic Ca2+ so that these signals involve Ca2+-induced Ca2+-release (CICR). IP3Rs are organized in clusters. The signals they mediate are observed using single-wavelength dyes and, often, a slow Ca2+ buffer (EGTA) is added to disrupt CICR between clusters and keep the signals spatially restricted. It is assumed that the presence of the dye or of EGTA does not alter the intra-cluster Ca2+ dynamics. In this paper we analyze this issue combining experiments and numerical simulations. We compare the properties of local signals known as puffs observed with different dyes and EGTA concentrations. We determine that although the dye or EGTA does not alter the intra-cluster dynamics, the set of observable events is different depending on the degree of inter-cluster uncoupling of the experiment. An analysis of the observations shows that the events that are missed for insufficient inter-cluster uncoupling are those of fastest amplitude growth rate. This agrees with a spatial organization in which the largest amplitude events correspond to clusters with densely packed active IP3Rs.Fil: Piegari, Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Sigaut, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentin

FCS experiments to quantify Ca2+ diffusion and its interaction with buffers

Ca2+ signals are ubiquitous. One of the key factors for their versatility is the variety of spatio-temporal distributions that the cytosolic Ca2+ can display. In most cell types Ca2+ signals not only depend on Ca2+ entry from the extracellular medium but also on Ca2+ release from internal stores, a process which is in turn regulated by cytosolic Ca2+ itself. The rate at which Ca2+ is transported, the fraction that is trapped by intracellular buffers, and with what kinetics are thus key features that affect the time and spatial range of action of Ca2+ signals. The quantification of Ca2+ diffusion in intact cells is quite challenging because the transport rates that can be inferred using optical techniques are intricately related to the interaction of Ca2+ with the dye that is used for its observation and with the cellular buffers. In this paper, we introduce an approach that uses Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) experiments performed at different conditions that in principle allows the quantification of Ca2+ diffusion and of its reaction rates with unobservable (non-fluorescent) Ca2+ buffers. To this end, we develop the necessary theory to interpret the experimental results and then apply it to FCS experiments performed in a set of solutions containing Ca2+, a single wavelength Ca2+ dye, and a non-fluorescent Ca2+ buffer. We show that a judicious choice of the experimental conditions and an adequate interpretation of the fitting parameters can be combined to extract information on the free diffusion coefficient of Ca2+ and of some of the properties of the unobservable buffer. We think that this approach can be applied to other situations, particularly to experiments performed in intact cells.Fil: Sigaut, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Villarruel, Cecilia Liliana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin